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水杉自然居群遗传多样性的RAPD研究

发布时间:2013-09-25 00:00 编辑:星斗山

水杉(Metasequoia glyptostroboides Hu et Chen)是中国著名[1]的杉科孑遗植物,其现生自然居群仅局限于四川、湖北、湖南三省交界处。由于水杉独特的发现历史和命名过程以及较为完整的化石记录,该种自建立以来一直为生物学家所注目。迄今为止,水杉的研究多限于形态学、解剖学及生态学方法,这些传统方法没有揭示其居群层次上的差异,而有关水杉在DNA水平上的遗传变异研究尚未见报道。采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术为居群、种乃至属间的遗传多样性研究提供了一个快捷有效的方法。本文以水杉原产地的原生水杉为材料,用RAPD分析技术,试图了解其居群层次上的遗传多样性水平,为更加深入地研究我国这一珍贵活化石提供数据。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料

 水杉营养枝上的成熟新鲜叶片,直接采自四川、湖北、湖南三省交界处(表Ⅳ—7—1)。

  1.2 基因组DNA提取[2]

用CTAB法提取基因组DNA,其浓度由Gel Doc 1000法测定,经硅胶乳液纯化。

表Ⅳ—7—1 样品的特征及产地

编 号

标本号

产 地

环 境

编 号

标本号

产 地

环 境

1

GH01

桂花管理区

庭院

15

XHZ13**

桂花管理区

村内

2

GH02

桂花管理区

庭院

16

XG01

兴国管理区

公路

3

GH05

桂花管理区

庭院

17

XG02

兴国管理区

庭院

4

XH01

小河管理区

公路

18

GH03

桂花管理区

公路

5

XH02

小河管理区

桥头

19

GH04

桂花管理区

公路

6

XH03

小河管理区

村内

20

SZ01

狮子坝管理区

河边

7

XH04*2}

小河管理区

庭院

21

SZ02

狮子坝管理区

河边

8

XHZ001**3}

桂花管理区

学校

22

PM01

湖南省龙山县洛塔乡

庭院

9

XHZ01**

小河管理区

村内

23

CQ01

重庆市石柱县

村内

10

XHZ03**

小河管理区

村内

24

CQ2

重庆市石柱县

村内

11

XHZ04**

小河管理区

村内

25

CQ03

重庆市石柱县

村内

12

XHZ05**

桂花管理区

村内

26

SM01

杉木管理区

学校

13

XHZ08**

桂花管理区

村内

27

MD01

湖北省利川市谋道镇

桥边

14

XHZ09**

桂花管理区

公路

1)所有标本的采集时间为1997年7月,编号1~21,26的产地均为湖北省利川市忠路镇;

2)*标本为栽培树,其它的标本为原生树;

3)**标本为来自原生树的嫁接树(采自小河水杉母树管理站;所列产地均指母树的原产地)

  1.3 PCR扩增

扩增反应在Perkin Elmer Gene Amp PCR System 9600上进行。反应体积为10μL,其成分为:2~3ng DNA模板,15mmol/L MgCl2,0.25 mmol/L dNTPs,10×buffer,2.7μmol/L引物(Sangon公司),025U Taq DNA聚合酶(南京生达公司)。扩增程序94℃ 2min预变性。94℃0。5min,35℃1min,72℃15min,40次重复。最后72℃延伸7min。

  1.4 PCR产物的鉴定

用ρ=1 4%琼脂糖电泳(TBE系统),EB染色。以100碱基对Ladder DNA和λDNA/EcorⅠ +HindⅢ(MBI公司)作为相对分子质量标准,使用Gel Doc(BIORAD公司)图像分析仪作观察并照相。

  1.5 数据处理与分析

统计扩增产物较为稳定的11个引物在27个样品中的扩增情况,在电泳图谱上同一RAPD位点上有电泳带记为1,无电泳带的记为0,作0,1矩阵表输入计算机。采用RAPDistance Package计算遗传距离并作聚类分支图。

  2 实验结果

  2.1 RAPD引物筛选

随机选取5个样本,对50个引物进行筛选,从中选出扩增条带清晰,重复性较好的20个引物,用此20个引物对所有的样本进行扩增(表Ⅳ—7—2),最后对扩增效果较为稳定的11个引物所产生的条带进行统计分析。

  2.2 PCR扩增结果

11个引物扩增获得的DNA片段121条,每个引物产生5~15条,长度在200~2000碱基对之间,其中64条带有多态性,占53%(见表Ⅳ—7—2)。

表Ⅳ—7—2 RAPD引物及其扩增情况

引 物

序 列

扩增出

条带数

非多态性

条带数

多态性

条带数

引 物

序 列

扩增出

条带数

非多态性

条带数

多态性

条带数

S7

CCTGACGCAG

12

5

7

58.3

S213

AGGACTGCCA

11

7

4

36.4

S122

CAGGATCCCT

10

5

5

50.0

S216

GGTGAACGCT

10

1

9

90.0

S123

CCTGATCACC

5

1

4

80.0

S220

GACCAATGCC

11

8

3

273

S125

CCGAATTCCC

15

9

6

40.0

S372

TGGCCCTCAC

11

7

4

36.4

S130

GGAAGCTTGG

13

8

5

38.5

S382

TGGGCGTCAA

11

3

8

72.7

S187

TCCGATGCTG

12

3

9

75.0

总计

121

57

64

52.9

  2.3 多态性条带所占的比例(如图Ⅳ—7—1)。

图Ⅳ—7—1 引物S122 扩增水杉基因组DNA的图谱

3 结果分析与讨论

根据扩增结果,采用Neighbour Joining法构建样品遗传距离聚类图(图Ⅳ—7—2),聚类图显示,相同分布小区内个体间的遗传距离总体上小于不同分布小区的个体间遗传距离。因此,影响水杉自然居群中个体间遗传距离参数的主要因素是所处地理位置的相对距离;此外,其它因素也可能产生一定的影响。如样品XHZ001~XHZ13均为原生树的克隆个体(已知原生树产地的嫁接树)与同区内原生树(XH01~XH03)在聚类图上分属不同的相邻分支。尽管不能排除实验过程可能造成的影响,但从RAPD距离聚类分支的结果判断,RAPD结果较好地反应了水杉自然居群(含原生树的直接克隆个体)内的遗传信息。采用RAPD多态性条带百分比(PPB)来度量水杉遗传多样性水平。根据样品的分析结果,水杉自然居群内总PPB值为52 9%,这些水杉样品在不同分布小区内的PPB值变异范围以及它们与松柏目其它物种的同类结果的比较如表Ⅳ—7—3大体上看,PPB值与样品的数目呈正相关;不同分布小区之间的PPB值存在较大变异范围,如兴国管理区(10%)和狮子坝管理区(5%)在样品数目相同(均为2个)的情况下,PPB值有明显差异。松柏目的银杉(Cathayaargyrophlla)、台湾油杉(Keteleeria formosana)、白云杉(Picea glauca)、黑云杉(Picea mariana)的RAPD PPB值在32%~85%之间(表Ⅳ—7—3),其中同为濒危物种的银杉遗传多样性水平最低(32%)。与它们相比,水杉居群的遗传多样性(PPB约为52%)在这些松柏目物种中处于中等水平,它高于银杉、而明显低于白云杉的PPB值。

图Ⅳ—7—2 根据RAPD分析的数据,用NJ法做出的27个水杉样品的聚类图

表Ⅳ—7—3 水杉居群及松柏目其它几个物种的PPB值

物 种

产 地

样品个数

引物个数

扩增条带数

多态性条带

(P/%)

水 杉

27

11

121

64(53)

湖北

23

11

121

62(51)

桂花管理区

10

11

121

50(41)

小河管理区

7

11

121

42(35)

兴国管理区

2

11

121

12(10)

狮子坝管理区

2

11

121

6(5)

杉木管理区

1

谋道镇

1

湖南

1

四川

3

11

121

7(6)

银杉

71

21

106

34(32)

台湾油杉

71

17

273

233(85)

白云杉

3

11

106

58(55)

黑云杉

3

11

95

42(44)

水杉的自然居群分布范围已从历史上的广泛地域(白垩纪和第三纪在北半球极为繁茂) 缩减为当今川湘鄂交界附近的数10km2以内。一般认为,濒危物种的遗传多样性水平较低,银杉的研究结果便印证了上述观点。然而,水杉自然居群的遗传多样性水平大于银杉,在松柏类植物中并不偏低。结果说明:① 濒危植物的遗传多样性水平具有一定的变异范围;②水杉较丰富的遗传多样性反映了该自然居群祖先群的遗传构成可能不是单一的;尽管孑遗物种水杉的自然种群的目前分布范围和个体数目非常有限,但是它仍然保持着中度的遗传多样性水平。应当指出,上述结果有待于采取不同方法加以验证,特别是更需综合水杉的历史与地理演化资料,实施居群动态分析,从而进一步加以说明。

主要参考文献

1.FULLING E H. Metasequoia: fssil and living. Bot Rev, 1976,42:215~315

2.HUHH, CHENG WC. On the new family Metasequoiaceae and on Metasequoia glytostroboides, a living species of the genus Metasequoia found in Szechuan and Hupeh. Bll fan Mem lost Biol, New Ser, 1948,1(2):153~161

3.WILLIAMS J G K, KUBELIK A R, LIVAK K L DNA polymorphis ms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res, 1990, 18:6531~6535

4.DAVID M H, BARBARA K M, ELIZABETH A Z. Molecular System matics. Sunderland, Massochusetts, USA: Sirrauer Associates lnc, 1996.1

5.ARMSTRONGJ, GIBBS A, REAKAL R. The RAPDistance Package. Version 1.04(英特网发行)

6.WANG X Q, ZOU Y P, ZHANG D M. Genetic diversity analysis by RAPD in Cathaya argyrophylla Chun et Kuang. Science in China (C), 1997, 40(2):1945~1951

7.MOSSELER A, EGGER K, HUGHES G H. Low levels of genetic diversity in red pine confirmed by random amplified polymorphic DNA markers , Can J For Res, 1992, 22:1332

责任编辑:星斗山